Сабельник

Сабельник (Comarum palustre или Potentilla palustris) является распространенным прибрежным кустарником. Он имеет циркумбореальное распространение по всей Северной Америке, Европе и Азии, особенно в северных регионах. Чаще всего встречается на берегах озер, на болотистых берегах рек и на ручьев, часто рядом с плавучей листвой. Растение является «родителем» некоторых гибридов Fragaria-Comarum, декоративных растений, полученных путем скрещивания с клубникой.

Ветви растения распространяются на листья с тремя-семью узкими резко зазубренными листочками. Стебель имеет красновато-коричневую, низкорастущую, виноградную структуру. Цветы простираются от ветви, и имеют цвет от красного до фиолетового, и около 2,5 см в диаметре, цветут летом. Корни стеблей у основания поднимаются до 30 см.

Сабельник предпочитает торфяные почвы, но может расти и на влажных песчаных участках. Процветает в Зоне 3 USDA (минимум -40 °C). Вырастает до 30–46 см в ширину и 30–46 см в высоту при правильном выращивании. Содержит агримонин, активный эллагитаннин, обладающий анти-α-глюкозидазным и антидиабетическим потенциалом у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином.

Сахарный диабет (СД), хроническое нарушение обмена веществ, стал проблемой здравоохранения во всем мире. ¹⁾ Согласно отчету Всемирной организации здравоохранения, в 2014 году во всем мире от СД страдали около 422 миллионов человек по сравнению с 108 миллионами в 1980 году. Глобальная распространенность (стандартизированная по возрасту) диабета почти удвоилась с 1980 года, увеличившись с 4,7% до 8,5% во взрослой популяции ¹⁾. СД характеризуется персистирующей гипергликемией после нарушения выделения инсулина, активности инсулина или того и другого. Высокий уровень сахара в крови может вызывать долгосрочные осложнения, такие как сердечно-сосудистые и почечные расстройства, ретинопатия и плохой кровоток. Люди, у которых развивается диабет 2 типа, проходят через фазу нарушения толерантности к глюкозе (IGT), которая характеризуется дефектами действия и / или секреции инсулина. Любое вмешательство в фазу IGT, которое снижает резистентность к инсулину или защищает β-клетки или оба дейсвтвия одновременно, должно предотвратить или задержать прогрессирование диабета. Ингибирование α-глюкозидазы, ключевого кишечного фермента, участвующего в переваривании углеводов, является одним из возможных путей предотвращения диабета. Его ингибирование вызывает снижение как постпрандиальной гипергликемии, так и гиперинсулинемии, и, таким образом, может улучшить чувствительность к инсулину и уменьшить стресс на β-клетках. Гипогликемические синтетические ингибиторы α-глюкозидазы, примером которых является акарбоза, были одобрены для клинического применения при контроле диабета 2 типа. Однако применение таких средств осложняется неблагоприятными желудочно-кишечными побочными эффектами (дискомфорт в животе, метеоризм и диарея) и может ограничивать долгосрочное соблюдение терапии. Кроме того, акарбоза плохо переносилась у детей с идиопатической постпрандиальной гиперинсулинемической гипогликемией ²⁾. Таким образом, натуральные ингибиторы α-глюкозидазы вызывают значительный интерес для лечения СД. Лекарственные растения постепенно приобретают мировое признание, учитывая их потенциал в качестве источника биологически активных веществ с потенциальным применением в качестве фармацевтических препаратов. Противодиабетическое растительное соединение может оказывать благоприятное воздействие в диабетической среде, улучшая или имитируя действие инсулина и / или усиливая секрецию инсулина. Появляется все больше доказательств того, что полифенольные соединения из разных семейств растений обладают мощной ингибирующей активностью в отношении α-глюкозидазы и ответственны за снижение уровня глюкозы в крови. Семейство Rosaceae включает около 110 родов и около 4830 видов. Розовые растения с предполагаемыми антидиабетическими свойствами были использованы в народной медицине, традиционных системах лечения, а также в качестве дополнительной и альтернативной медицины. Было доказано, что некоторые вещества, содержащиеся в розовых растениях, таких как Vauquelinia corymbosa и Prunus domestica, ингибируют α-глюкозидазу. В последнее время большое внимание уделяется членам подсемейства Rosoideae в связи с их высокой активностью ингибирования α-глюкозидазы, в частности, представителям рода Rubus-R. fruticosus (ежевика) и R. idaeus. Сабельник (Comarum palustre L.) является еще одним членом подсемейства Rosoideae. Это низкорослое травянистое растение, встречающееся в умеренных зонах по всему земному шару и чаще всего во влажных, болотистых местах Европы, Азии и Северной Америки. Водные экстракты C. palustre и его корней широко используются в народной медицине Сибири для лечения различных заболеваний человека, таких как гипертония, ревматический артрит, ишемическая болезнь сердца и т. д. Более того, имеются данные о применении этого вида растений для лечения СД и его использовании в качестве гипогликемического средства ³⁾. Известные литературные данные по химическому составу и биологической активности относятся, прежде всего, к пектическому полисахариду comaruman, выделенному из надземных частей, и его противовоспалительной активности, что говорит о низком общем уровне знаний о химических и фармакологических данных этого вида растений, и предлагает необходимость дальнейшей работы в этом направлении. Настоящее исследование, находящееся сейчас на начальных этапах, направлено на изучение наибольшего ингибирующего действия водных и этанольных экстрактов из различных частей C. palustre (травы, корни, цветы, семена) на α-глюкозидазу, дальнейшего выявления наиболее активных соединения, ответственные за проявление анти-α-глюкозидазной активности с использованием профилирования на основе активности ВЭЖХ и выявления антидиабетического потенциала этих соединений и экстрактов в диабетической модели, индуцированной стрептозотоцином, у крыс.

Поскольку ингибирование α-глюкозидазы считается одним из наиболее эффективных подходов к лечению диабета, мы решили исследовать эту активность экстрактов C. palustre. Согласно многочисленным исследованиям, вода и этанол являются наиболее часто используемыми экстрагентами для таких исследований ⁴⁾. Из-за отсутствия общих рекомендаций по выбору экстрагента, были использованы вода и этанол. На предварительном этапе исследования мы использовали водные (отвар, настой) и этаноловые экстракты (настойка, 30%, 60%, 96% экстракты) из травы, корней, цветов и семян C. palustre, и изучили их ингибирующее действие на α -глюкозидазу. Исследование влияния экстрактов из C. palustre показало хорошее ингибирование α-глюкозидазы экстрактами травы и цветов по отношению к семенам и корням. Не было обнаружено никаких существенных различий между водными экстрактами: отвар и настой из травы C. palustre выявили сходные значения ингибирования α-глюкозидазы (IC50 127,4 и 142,9 мкг / мл соответственно). Водные экстракты из корней, цветов и семян не проявляли ингибирования активности α-глюкозидазы до концентрации > 300 мкг / мл, в то время как их этанольные экстракты обладали умеренной активностью. Наиболее активным был 60%-ный этанольный экстракт из травы, который показал наибольшую активность (IC50 52,0 мкг / мл); экстракт цветков был слабее (IC50 104,2 мкг / мл), а корни были еще менее активными (IC50 272,7 мкг / мл). Во всех случаях экстракции, экстракты из травы C. palustre были более активными, чем акарбоза (IC50 294,4 мкг / мл), известный ингибитор α-глюкозидазы, используемый в качестве положительного контроля. Основываясь на результатах анти-α-глюкозидазной активности экстрактов C. palustre, мы можем подтвердить потенциал 60% экстракта из травы C. palustre в качестве хорошего источника ингибиторов α-глюкозидазы.

Чтобы охарактеризовать химический профиль 60%-ного этанольного экстракта травы C. palustre, была применена ранее описанная процедура ВЭЖХ с обращенной фазой в микроколонках с УФ-и МС-детектированием (MC-RP-HPLC-UV-MS). Масс-спектральные данные экстракта травы C. palustre были получены в режиме отрицательных ионов, что дало больше структурной информации, чем в режиме положительных ионов. Сравнивая эти данные с данными для изолированных соединений или коммерческих стандартов, было идентифицировано 15 компонентов, четыре эллагитанина (α-педункулагин, β -педункулагин, потенцилин, агримониин), шесть флавоноидов (рутин, миквелианин, изокверцитрин, никотифлорин, астрагалин, афзелин), один катехин ((+) - катехин), 2-пирон-4,6-дикарбоновая кислота, галлиевая кислота B, процициновая кислота и эллаговая кислота. Все упомянутые соединения были выделены ранее из травы C. palustre сибирского происхождения. Для идентификации представляющих интерес соединений травы C. palustre с высокой активностью, ингибирующей α-глюкозидазу, исследуемый экстракт подвергали профилированию на основе активности ВЭЖХ. Этот метод представляет собой миниатюрный и высокоэффективный подход для локализации и характеристики биологически активных натуральных продуктов с минимальным количеством вводимых экстрактов. Этот метод сочетает в себе скорость и мощность разделения ВЭЖХ со структурной информацией онлайн-спектроскопии и миниатюрных биоанализов ⁵⁾. Для выявления ингибиторов анти-α-глюкозидазы в экстракте травы C. palustre была использована методика мелкомасштабного полупрепаративного микрофракционирования методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Это дало 20 микрофракций по 30 каждая, которые были перенесены в глубокий микротитровальный планшет. Затем микрофракции сушили, перерастворяли в буферном растворе и добавляли ферментный раствор для оценки ингибирования элюата α-глюкозидазой. Значительное ингибирование наблюдалось во временном интервале от 6,30 до 8,00 мин, что соответствует фракциям xiv-xvi, которые демонстрируют наибольший потенциал анти-α-глюкозидазной активности со значениями (1-A400) 0,53, 0,44 и 0,12 соответственно, тогда как активности других фракций существенно не отличались от нуля. Корреляция (1-A400) данных элюатов с характеристиками компонентов MC-RP-HPLC-UV-MS позволила нам выделить два хорошо разделенных основных и три малых пика с близкими временами удерживания: агримониин (8) при 6,98 мин, эллаговая кислота (9) в 7,20 мин, рутин (10) в 7,33 мин, микелианин (11) в 7,50 мин и изокверцитрин (12) в 7,72 мин. Наибольшее ингибирование α-глюкозидазы во фракции xiv было обусловлено присутствием единственного соединения, агримониина, которое относится к эллагитанинам. Ингибирующая эффективность эллагитанинов в отношении α-глюкозидазы была показана ранее. Однако наличие четырех веществ (эллаговой кислоты, рутина, миквелианина, изокверцитрина) в двух последующих фракциях не дало четкого ответа на вопрос об источнике ингибирующей активности. Согласно литературным данным, эллаговая кислота практически не проявляет ингибирования α-глюкозидазы ⁶⁾, в то время как флавоноиды могут быть эффективными в ингибировании активности α-глюкозидазы - в общей сложности 103 флавоноида, описанные в литературе, показали ингибирующую активность глюкозидазы. Однако McDougall и соавт. показали, что различные фенольные соединения могут влиять на разные стадии переваривания синергетическим образом - удаление из экстракта эллагитанинов с ранее доказанной высокой ингибирующей активностью в отношении α-глюкозидазы, в конечном итоге, замедляет ингибирование фермента. Таким образом, мы решили удалить эллагитанины из экстракта травы C. palustre, чтобы выяснить, как это повлияет на ингибирование α-глюкозидазы.

Количественная оценка основных фитохимических веществ в экстракте C. palustre (названном экстракте A) была выполнена ранее описанной процедурой MC-HPLC-UV. Результаты показали, что общее содержание поддающихся количественному определению соединений в экстракте C. palustre составляло 488,56 мг / г. Наибольшее содержание, 284,35 мг / г, было обнаружено для эллагитанинов с агримониином в качестве доминирующего соединения (240,94 мг / г). Общая концентрация флавоноидов составляла 135,75 мг / г, при этом миквелианин и астрагалин в качестве основных соединений присутствовали в количестве 80,81 и 25,40 мг / г соответственно. Обнаруживаемые количества (+) - катехина и процианидина B3 были обнаружены в экстракте C. palustre со значениями 28,02 и 30,02 мг / г соответственно. Некоторые компоненты, такие как галловая кислота, 2-пирон-4,6-дикарбоновая кислота и эллаговая кислота, были незначительными. Удаление эллагитанинов из экстракта C. palustre осуществляли с использованием процедуры твердофазной экстракции полиамида (SPE). В конечном итоге, был получен детинированный экстракт (названный экстрактом B). Количественное определение фенольных компонентов в экстракте B показало отсутствие галловой кислоты, α-педункулагина, β-педункулагина, (+) - катехина, потенциллина и эллаговой кислоты, которые были связаны с полиамидным сорбентом. Общее содержание эллагитанина в B-экстракте составляло 1,03 мг / г, а общая концентрация флавоноидов составляла 196,99 мг / г. Результаты количественного определения ВЭЖХ являются четким доказательством того, что экстракт B представляет собой экстракт, содержащий ацетаннифы, с низким содержанием эллагитанинов. Чтобы оценить анти-α-глюкозидазную активность экстракта A, B и агримониина, наиболее активного ингибитора ферментов, согласно нашим результатам скрининга, ингибирующую активность в отношении α-глюкозидазы родственных экстрактов и соединений оценивали с использованием анализов in vitro. Значения IC50 для экстрактов A и B составляли 52,0 и 204,7 мкг / мл, соответственно, демонстрируя наиболее сильное ингибирование α-глюкозидазой экстрактов травы C. palustre перед удалением танина. Сравнивая активность акарбозы в качестве эталонного соединения (IC50 294,4 мкг / мл), полученные данные четко продемонстрировали высокую ингибирующую активность экстракта травы C. palustre. Параметр ингибирования фермента доминантного агримониина составил 21,8 мкг / мл, что подтверждает его ведущую роль в анти-α-глюкозидазной активности экстракта C. palustre. Согласно данным литературы, флавоноиды с высокой анти-α-глюкозидазной активностью обычно обладают следующими структурными особенностями: (1) наличие двойной связи C2 = C3 в кольце C; (2) дигидроксильная группа в кольце B; и (3) присутствие С-5 и С-7 гидроксильных групп в кольце А; одним из наиболее известных флавонолов является кверцетин ⁷⁾. По результатам скрининга, все потенциально активные флавоноиды в экстракте травы C. palustre - ингибиторы α-глюкозидазы (миквелианин, изокверцитрин, рутин) - связаны с гликозидами кверцетина и обладают схожей химической структурой. Микелианин и изокверцитрин являются моногликозидами кверцетина, а рутин - его дигликозид. Ранее было показано, что гликозилирование флавонолов, очевидно, ослабляет их ингибирующую активность в отношении α-глюкозидазы. Li et al. сравнивали эффекты кверцетина, изокверцетина и рутина в качестве ингибиторов α-глюкозидазы со значениями IC50 0,017, 0,185 и 0,196 мМ / л соответственно по сравнению с IC50 акарбозы 0,091 мМ / л. Ингибирующая активность кверцетиновых гликозидов снизилась более чем в 10 раз по сравнению с агликоном. Также было показано, что моногликозиды флавоноидов являются лучшими ингибиторами α-глюкозидазы, чем их полигликозидные формы, поэтому можно сделать вывод о том, что ингибирующая активность миквелианина и изокверцитрина в отношении α-глюкозидазы была близкой и слабой; рутин обладал худшей ингибирующей активностью по отношению к этому ферменту. В свою очередь, высокая ингибирующая активность эллагитанинов, доминирующих в экстракте A травы C. palustre, относительно α-глюкозидазы может быть объяснена специфическим свойством, таким как способность осаждать некоторые белки. Осаждение белка происходит как поверхностное явление, при котором фенольные группы танинов связываются с поверхностью белка ⁸⁾. Что касается принципа ассоциации между полифенолами и белком при низких концентрациях, было высказано предположение, что полифенолы связываются с одним или несколькими участками поверхности белка и образуют гидрофобный монослой, который затем вызывает агрегацию и осаждение. Напротив, при высоких концентрациях белка полифенолы образуют комплексы и сшиваются с белком, и благодаря этому многократному взаимодействию они образуют гидрофобную поверхность и, таким образом, вызывают осаждение. Механизмом ингибирующей активности в отношении α-глюкозидазы эллагитанинов из анализируемого экстракта может быть связывание танина с белком, которое вносит изменения в конформацию фермента и снижает активность α-глюкозидазы за счет ассоциации и осаждения.

Появляется все больше доказательств того, что полифенольные соединения, особенно эллагитанины, из растений могут вызывать инсулиноподобные воздействия на утилизацию глюкозы. Ранее была показана способность димерных эллагитанинов из экстракта клубники снижать повышенный уровень глюкозы в крови. В связи с этим мы решили оценить гипогликемическую активность экстрактов C. palustre (A и B) и оценить ту же активность для преобладающего димерного эллагитаннина агримониина. В качестве экспериментальной диабетической модели использовался тип 2, поскольку низкая доза диабетогенного агента стрептозотоцина (STZ; 60 мг / кг) частично разрушает бета-клетки островков Лангерганса, вызывая неадекватные выделения инсулина, вызывая диабет типа 2. Недостаточное выделение инсулина вызывает гипергликемию, что приводит к окислительному повреждению в результате образования активных форм кислорода и развития диабетических осложнений ⁹⁾. Это модель на животных, обычно используемая для диабетических исследований. В настоящем исследовании наблюдалась выраженная потеря веса у животных, получавших STZ, по сравнению с контрольной группой. Снижение массы тела может быть связано с истощением инсулина, провоцирующим потерю жировой ткани. Внутривенные инъекции нормальным крысам с STZ вызывали статистически значимое (p <0,001) повышение уровня глюкозы в сыворотке (более 350% от базальной гликемии) через 72 часа после инъекции по сравнению с контрольной группой (группа 1) без лечения. Кроме того, значительное снижение уровня инсулина в плазме (6,97 Ед / л против 15,90 Ед / л в контрольной группе; р <0,01) и общего гемоглобина (7,11 мг / дл против 14,02 мг / дл в контрольной группе; р <0,01) было наблюдается в диабетической группе, а также значительное повышение уровня гликозилированного гемоглобина (HbA1C; 12,93% Hb против 4,82% Hb в контрольной группе; p <0,01). Все упомянутые изменения указывают на слабый гликемический контроль, и эти результаты согласуются с диабетом 2 типа. Пероральное введение экстракта А значительно увеличивало массу тела у крыс с диабетом по сравнению с группой STZ с максимальным уровнем при дозе 400 мг / кг. Увеличение массы тела было значительно ниже у крыс, получавших экстракт В, чем в группе, получавшей экстракт А. Агримониин приводил к наиболее значительному увеличению массы тела с более отчетливыми значениями при дозе 100 мг / кг, аналогично данным группы инсулина. Снижение уровня глюкозы в крови зависело от дозы и наблюдалось с седьмого дня обработки у диабетических крыс, получавших экстракты C. Palustre из травы, агримониин и инсулин, достигая максимальных значений через 21 день. У STZ диабетических крыс экстракт A C. palustre (400 мг / кг, группа 5) проявлял большую гипогликемическую активность с постепенным снижением гликемии до достижения максимума через 21 день (113 мг / дл). Применение экстракта B C. palustre (400 мг / кг, группа 8) показало низкую активность в снижении ответа уровня глюкозы в крови натощак, достигая максимального значения 198 мг / дл через 21 день. Обработка диабетических крыс раствором агримониина (100 мг / кг, группа 11) показала значительное снижение уровня глюкозы в сыворотке на 14 день эксперимента (111 мг / дл). После 21 дня лечения диабетических крыс раствором агримониина в той же концентрации, уровень глюкозы в крови натощак снизился до 87 мг / дл, что было только на 10% выше, чем у диабетических крыс, получавших инсулин (группа 12), и на 14% выше, чем у контрольных недиабетических крыс (группа 1). Обработка недиабетических крыс с максимальными концентрациями экстракта травы C. palustre A (400 мг / кг, группа 13), экстракта травы C. palustre B (400 мг / кг, группа 14) и агримониина (100 мг / кг, группа 15) не влияла на уровень глюкозы в крови натощак в течение 21 дня эксперимента. Введение экстрактов А и В и агримониина в увеличивающихся концентрациях приводило к повышению уровня инсулина в плазме у крыс, получавших STZ. Максимальное повышение уровня инсулина в плазме наблюдалось в группе агримониина при дозе 100 мг / кг, а крысы, получавшие экстракт А, получали дозу 400 мг / кг. Обработка экстрактом А и агримониином крыс с диабетом значительно дозозависимым образом увеличивала уровень общего гемоглобина (Hb) и значительно снижала уровень глюкозилированного гемоглобина (HbA1c) по сравнению с крысами с диабетом. Эффективность экстракта В была недостаточной. Параметры недиабетических групп, получавших наибольшую дозу экстракта А и В (400 мг / кг), а также агримониина (100 мг / кг), были близки к контрольной группе, не демонстрируя влияния на здоровых животных. Таким образом, среди исследованных образцов экстракта C. palustre A и агримониина значительно снижали (p <0,001) уровень глюкозы в сыворотке и нормализовали параметры массы и крови (уровни инсулина, общего и гликозилированного гемоглобина) в модели диабетических крыс STZ. Антидиабетический эффект экстракта C. palustre B после удаления эллагитаннина показал низкую активность в снижении уровня глюкозы в крови натощак в той же модели. Вероятным механизмом антидиабетического потенциала экстракта C. palustre может быть его инсулиногенная активность. Наблюдаемое повышение уровня инсулина в плазме указывает на то, что экстракт C. palustre стимулирует секрецию инсулина из существующих или регенерированных β-клеток. Следует отметить, что в процессе повышения гликирования белков, в том числе гемоглобина, возникают диабетические осложнения. Неферментативное, необратимое связывание глюкозы с гемоглобином приводит к образованию гликозилированной формы (HbA1c), которая была повышена у крыс, обработанных экстрактом C. palustre, поэтому можно сделать вывод, что это снижение уровня HbA1c может быть вызвано снижением гликозилирования гемоглобина. Полученные данные подтвердили ведущую роль агримониина в противодиабетическом действии травы C. palustre. Ранее было показано, что водный экстракт Agrimonia eupatoria снижает гипергликемию у мышей с диабетом, вызванным STZ. Механизм гипогликемического действия экстракта Agrimonia был изучен in vitro на изолированных кусочках мышц и состоял из улучшенного транспорта глюкозы, окисления глюкозы, гликогенеза и выделения лактата, сравнимого с 0,01 мкМ инсулина ¹⁰⁾. Granica et al. установили, что агримониин является доминирующим соединением в водном экстракте Agrimonia eupatoria. Эти данные подтвердили, что гипогликемическое действие агримониина преобладает также и у сабельника. Таким образом, C. palustre представляет собой возможное диетическое дополнение для лечения СД и может быть источником нового перорального гипогликемического препарата.

:Tags